常見問題

常見問題

抗體常見問題

  • 工作液和濃縮液的區(qū)別？
    工作液主要針對(duì)病理醫(yī)生用，為了他們方便，不再自行稀釋。
    如果是科研用，抗體的稀釋比例還是需要研究者自行摸索，染色強(qiáng)度最高，而背景值又最低。也就是需要找到最高信噪比的最佳比例。
  • 抗體用什么稀釋？
    抗體稀釋最好使用抗體稀釋液。因?yàn)榭贵w稀釋液可以有效保證抗體蛋白的穩(wěn)定性。
    抗體也可以用PBS緩沖液配制，但是必須現(xiàn)用現(xiàn)配。
  • 抗體如何保存？
    抗體保存得當(dāng)與否，直接決定了抗體的活性和使用效果！因此請(qǐng)務(wù)必按照說明書推薦的保存條件正確保存抗體！并且避免抗體反復(fù)凍融。
  • 抗體如何運(yùn)輸？
    雖然好多抗體的保存溫度是-20度，但是目前抗體的運(yùn)輸都為4度運(yùn)輸。目的是為了避免反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害（如果使用干冰運(yùn)輸，那么收到時(shí)抗體是凍起來的，為了分裝就需要解凍。這就多了一次凍融的過程）。所以運(yùn)輸過程中絕對(duì)避免干冰運(yùn)輸！

檢測(cè)系統(tǒng)常見問題

  • 為何非生物素法檢測(cè)系統(tǒng)不用血清封閉？
    血清封閉的作用是封閉掉組織中的帶電荷團(tuán)，防止它們與抗體結(jié)合，產(chǎn)生非特異染色．這并不影響接下來一抗的結(jié)合，因?yàn)檫@種結(jié)合是特異的，親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于因電荷作用的結(jié)合，血清與非特異性位點(diǎn)結(jié)合，可以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景。
  • 如何選擇合適的檢測(cè)系統(tǒng)？
    目前，推薦使用非生物素法檢測(cè)系統(tǒng)，因?yàn)榭梢员苊鈨?nèi)源性生物素的干擾。您購(gòu)買一抗的種屬來源和組織是兩個(gè)考慮要素。如果組織是人標(biāo)本，一抗來源是小鼠，那么可以選擇通用型或者以2結(jié)尾的檢測(cè)系統(tǒng)；一抗來源是兔，那么選擇通用型或者以1結(jié)尾的。但是組織并不局限于人的標(biāo)本，當(dāng)然必須是能夠排除交叉性反應(yīng)的動(dòng)物組織。比如，一抗是小鼠來源，再用于小鼠組織，那么小鼠組織內(nèi)源性IgG就會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

免疫組化常見問題

  • 無染色
    A. 真陰性。
    解決的方法非常簡(jiǎn)單，就是設(shè)立“陽(yáng)性對(duì)照”。如果陽(yáng)性對(duì)照有了表達(dá)，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時(shí)測(cè)試片仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽(yáng)性對(duì)照沒有著色，表明染色過程中某個(gè)或某些步驟出了問題或試劑出了問題。
    B. 假陰性。
    （1） 是否加了試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
    （2）試劑是否按正確的順序加入以及孵育了足夠的時(shí)間。
    （3） 檢測(cè)系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點(diǎn)是非常重要的。
    （4）二抗檢測(cè)系統(tǒng)與顯色試劑不匹配。
    （5）抗體的稀釋比例是否過大及稀釋抗體的溶液是否正確。
    （6）標(biāo)本中抗原含量過低也會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果?？墒褂糜蟹糯笮?yīng)的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
    （7）所檢標(biāo)本或切片的組織抗原是否丟失，如標(biāo)本未及時(shí)固定或切片在室溫放置時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)使抗原丟失。最好用已知陽(yáng)性的標(biāo)本來同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照。
    （8）抗體是否過了有效期和抗體的保存條件是否正確。
    （9） 色原/底物溶液是否失效，最簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法是將一滴標(biāo)記有酶的抗體滴加在一張白紙上，然后將制備好的底物溶液滴在上面，如果發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。
    （10）水溶性色原顯色后使用了含醇的復(fù)染液或用乙醇脫水、二甲苯透明（如AEC、BCIP/NBT、AP-Red等顯色試劑）。解決的辦法是重新染色。
    （11）沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。
  • 弱陽(yáng)性
    A. 標(biāo)本的固定方式。不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r(shí)溫度過高，都會(huì)影響到所檢測(cè)的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。
    B. 抗原的修復(fù)方式。煮沸修復(fù)和高壓修復(fù)是國(guó)際公認(rèn)的較好的修復(fù)方式，但具體使用那種修復(fù)方式應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或廠家說明書進(jìn)行選擇。
    C. 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時(shí)間是否正確。應(yīng)參照使用范圍，對(duì)所使用的一抗進(jìn)行梯度測(cè)試，找出最佳的使用濃度。
    D. 切片上遺留了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。
    E. 孵育時(shí)切片是否放置水平，否則會(huì)導(dǎo)致抗體流失。
  • 非特異性染色
    A. 是否有效地去除了內(nèi)源性酶和生物素。應(yīng)注意的是，并不是每一種組織均需要進(jìn)行此步驟，但對(duì)于內(nèi)源性酶或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。
    B. 滅活堿性磷酸酶：當(dāng)使用堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)時(shí)應(yīng)滅活內(nèi)源性的堿性磷酸酶。
    C. 滅活內(nèi)源性過氧化物酶：當(dāng)使用DAB顯色系統(tǒng)時(shí)應(yīng)滅活內(nèi)源性過氧化物酶。
    D. 取材時(shí)避開出血、壞死區(qū)亦極重要。因?yàn)槌鲅蛪乃绤^(qū)內(nèi)源性酶含量高，極易產(chǎn)生非特異染色。
    E. 所選擇的抗體是否符合實(shí)驗(yàn)要求。因抗體不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過采用高純度、高效價(jià)的抗體、或針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
    F. 一抗的使用濃度是否過高。有些抗體濃度過高會(huì)使肌組織或纖維組織產(chǎn)生非特異著色。
    G. 清洗是否充分。清洗時(shí)既要清洗干凈又不能使切片脫片，這是洗滌的原則。溶液內(nèi)加入Tween-20，即可提高洗滌效果又可增加組織的通透性，使抗體與組織的結(jié)合更強(qiáng)。
    H. DBA的使用是否正確。DAB的孵育時(shí)間、保存和配制方式都可以產(chǎn)生某些背景顏色。
    I. 標(biāo)本染色過程中是否曾經(jīng)干涸，否則會(huì)造成邊緣部的非特異性染色。
    J. 巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。
  • 全片著色
    A. 抗體濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度。
    B. 抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高。解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程。
    C. DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。
    D. 組織變干。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用免疫組化筆在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
    E. 切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）。
    F. 一抗變質(zhì)或質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要么不顯色、要么背景著色。最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過的抗體作比較。
  • 陰陽(yáng)臉”著色 “陰陽(yáng)臉”著色
    A. 組織脫蠟時(shí)脫蠟液未沒過組織，使部分組織脫蠟不足或未脫蠟。
    B. 抗原修復(fù)時(shí)修復(fù)液未沒過組織使組織干燥，干燥的組織則不顯色。
    C. 滴加的抗體（一抗或二抗）流到了組織的一側(cè)，這是切片不平的緣故。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)檢查。
    D. 加抗體時(shí)未完全覆蓋組織：如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。
    E. 用免疫組化筆在組織周圍畫圈時(shí)，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達(dá)到靠近劃線附近的組織也會(huì)出現(xiàn)這部分組織不顯色。
    F. 加抗體時(shí)產(chǎn)生了氣泡，氣泡下面的組織不顯色。由于氣泡中含氣，試劑被推到周圍，因此，氣泡中心的組織會(huì)產(chǎn)生圓形的不著色。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破。
  • 灶片狀著色
    A. 裱片時(shí)水未排盡，或組織的局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過深。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，漂片時(shí)一旦產(chǎn)生了氣泡可將鑷子伸到水里從組織下面輕輕將氣泡移走。撈片后要傾斜放置幾分鐘利于水流走，然后在放到烤片儀上進(jìn)行烤片。
    B. 壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的組織。
    C. 制作膠片時(shí)，膠的濃度太高，膠在載玻片上不均勻，顯色時(shí)膠厚的地方容易非特異灶片狀著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行。
  • 抗體易位表達(dá)
    A. 錯(cuò)誤的抗原修復(fù)方式，是抗體表達(dá)易位的常見原因。
    B. 不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)、組織變干等，解決辦法是嚴(yán)格按照操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行工作。

FISH常見問題

  • 消化不足
    表現(xiàn)：
    細(xì)胞成塊，沒有清楚的邊界；
    信號(hào)弱，可見細(xì)胞間連接物。
    解決：
    檢查酶溶液的溫度并增加消化時(shí)間；
    檢查預(yù)處理液的溫度并增加預(yù)處理的時(shí)間。
  • 過消化
    表現(xiàn)：
    沒有清楚的細(xì)胞邊界，細(xì)胞形態(tài)被破壞；
    可能有弱的或缺失的信號(hào)；
    熒光背景高。
    解決：
    檢查酶溶液的溫度并減少消化時(shí)間；
    檢查預(yù)處理液的溫度并減少預(yù)處理的時(shí)間。
  • 過預(yù)處理
    表現(xiàn)：
    沒有清楚的細(xì)胞邊界，具不規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)；
    可能有弱的或缺失的信號(hào)。
    解決：
    檢查酶溶液的溫度并減少消化時(shí)間；
    檢查預(yù)處理液的溫度并減少預(yù)處理的時(shí)間。
  • 雜交時(shí)間不當(dāng)
    表現(xiàn)：
    形態(tài)正常、信號(hào)弱；
    解決：
    增加雜交時(shí)間；
    檢查探針量；
    檢查雜交后洗脫條件。
  • 背景高
    原因：
    雜交后洗脫不充分。
    解決：
    檢查洗脫液的溫度。
  • 信號(hào)強(qiáng)度變化
    原因：
    由于氣泡造成的探針不均勻分布。
    解決：
    重復(fù)實(shí)驗(yàn)并確認(rèn)雜交期間蓋玻片下無氣泡；
    在探針混合物的第一接觸面加蓋蓋玻片。
  • 組織掉片或組織形態(tài)分解
    原因：
    組織固定不足；
    使用不恰當(dāng)?shù)牟Ｆ?
    不正確的烤片；
    移除蓋玻片時(shí)組織被撕掉；
    過消化；
    過預(yù)處理。
    解決：
    校驗(yàn)固定條件；
    使用正確的玻片；
    校驗(yàn)烤片條件；
    泡更長(zhǎng)的時(shí)間使蓋玻片脫落。
  • 過變性
    表現(xiàn)：
    線狀信號(hào)。
    解決：
    檢查變性的時(shí)間和溫度。
  • 無/弱信號(hào)
    可能的原因 推薦的解決方案
    未添加探針（別笑，特別是探針和雜交緩沖液分開的非預(yù)混情況） 探針充分解凍，確保移液器吸取到探針試劑。
    探針、雜交緩沖液使用前沒有充分混勻（非預(yù)混探針） 吹打探針混合液，使探針充分混勻，短暫離心。
    探針添加數(shù)量不足 確保移液器吸取準(zhǔn)確，探針加入量足量，請(qǐng)不要稀釋探針（包括預(yù)混和非預(yù)混）。 使用前確保探針解凍充分并達(dá)到室溫。
    變性前標(biāo)本未制備好 請(qǐng)參照說明書中標(biāo)本制備相關(guān)說明。
    標(biāo)本及探針變性不充分 確保玻片進(jìn)行變性時(shí)溫度在推薦的溫度。 將玻片變性時(shí)間延長(zhǎng)2~4分鐘。
    變性前標(biāo)本未制備好 請(qǐng)參照說明書中標(biāo)本制備相關(guān)說明。
    標(biāo)本及探針變性不充分 確保玻片進(jìn)行變性時(shí)溫度在推薦的溫度。 將玻片變性時(shí)間延長(zhǎng)2~4分鐘。
    雜交條件不合適 確保遵守雜交所規(guī)定的時(shí)間和溫度。 橡皮膠封片時(shí)勿留縫隙。 根據(jù)情況，調(diào)整雜交時(shí)間（跨度一般較大）和濕度。
    雜交時(shí)蓋玻片下有氣泡形成 放蓋玻片時(shí)要覆蓋探針表面，輕輕擠壓以便擠出氣泡。
    玻片干燥不充分 探針滴加至玻片前，確保玻片上的乙醇溶液已經(jīng)完全揮發(fā)。
    探針干燥太快 探針滴加后應(yīng)立即將蓋玻片覆蓋目標(biāo)區(qū)域。 進(jìn)行洗脫時(shí)，一次只能移除一張玻片上的蓋玻片，并且在移除下一張之前立即將玻片浸入洗脫液中。
    洗脫液或洗脫條件不正確 確保按照產(chǎn)品說明書要求配制洗脫液（生產(chǎn)商提供洗脫液的除外）。 確保洗脫液的溫度達(dá)到洗脫步驟所規(guī)定溫度。 玻片浸入洗脫液前移去蓋玻片。
    探針或標(biāo)本玻片儲(chǔ)存不正確 確保探針-20℃避光保存。 將未雜交玻片干燥后置于-20℃長(zhǎng)期保存或者室溫短期保存（一般不超過兩星期）。 將雜交后玻片置于-20℃避光保存。
    觀察時(shí)所選用的濾光片不合適 使用正確濾光片觀察探針熒光情況。詳情咨詢探針供應(yīng)商。
    顯微鏡構(gòu)造及物鏡不適宜觀察FISH標(biāo)本，或者濾片組損傷 請(qǐng)聯(lián)系顯微鏡制造商。
    汞燈使用時(shí)間超過設(shè)計(jì)時(shí)間 請(qǐng)更換汞燈。