Pembrolizumab（Keytruda，MK-3475，Merck）是針對(duì)PD-1受體的抑制劑，于2014年9月被FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤以來，腫瘤醫(yī)生獲得了一個(gè)治療癌癥的新工具。美國(guó)前總統(tǒng)卡特在經(jīng)過PD-1抑制劑治療后，治愈了晚期黑色素瘤。這讓PD-1抑制劑一躍成為很多人眼中的“抗癌神藥”。目前很多研究已經(jīng)證實(shí)MSI-H/dMMR患者能夠從免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療中獲益。因此需要在治療前對(duì)患者進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)，以評(píng)估患者是否能從PD-1治療中獲益。

（一）MMR-IHC方法（Immunohistochemistry, IHC）

常用免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)腫瘤組織中錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達(dá)蛋白。任何一項(xiàng)蛋白的缺失，即為dMMR，間接說明微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），否則即為pMMR，間接說明微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。此方法檢測(cè)MSI相對(duì)較簡(jiǎn)單，成本較低，大部分病理科均可進(jìn)行檢查。

定位準(zhǔn)確，染色清晰，背景干凈

從全世界發(fā)病水平看，中國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病和死亡水平較低。但由于中國(guó)人口基數(shù)大，中國(guó)仍是乳腺癌國(guó)，發(fā)病和死亡絕對(duì)數(shù)量均位列全球首位。

中杉金橋錯(cuò)配四項(xiàng)

中杉金橋 PK 常規(guī)

（二）分子水平的檢測(cè)

1.MSI-PCR技術(shù)（polymerase chain reaction, PCR)

目前主要采用多重?zé)晒釶CR結(jié)合毛細(xì)管電泳的方法，來比較腫瘤組織與正常組織的位點(diǎn)突變情況。其用于比較的位點(diǎn)為美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），僅1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L），無位點(diǎn)改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。

但是關(guān)于最適合MSI檢測(cè)的位點(diǎn)仍存在爭(zhēng)議。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MMR免疫組化檢測(cè)結(jié)果與MSI的PCR檢測(cè)結(jié)果有高度關(guān)聯(lián)性，靈敏度92%，特異性可達(dá)100%，但花費(fèi)較高，且在結(jié)果判斷中會(huì)碰到以下問題：如熒光的過強(qiáng)或過少、非特異性峰、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等。

2.MSI-NGS方法（Next Generation Sequencing, NGS）

NGS做為新一代測(cè)序方法，又稱為第二代測(cè)序技術(shù)，是一種高通量測(cè)序技術(shù)，能一次性對(duì)幾十萬到幾百萬條基因分子進(jìn)行序列測(cè)定。目前NGS方法已經(jīng)成為檢測(cè)MSI的新工具，其最大優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)高通量檢測(cè)。

美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)與分子病理學(xué)和抗擊結(jié)直腸癌協(xié)會(huì)組織專家共召開了8次會(huì)議，審查了103篇相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)文章提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和定性分析，制定了該指南——《Mismatch Repair and Microsatellite Instability Testing for Immune Checkpoint Inhibitor Therapy》

該指南在評(píng)估現(xiàn)有的檢測(cè)方法時(shí)，考慮了錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的IHC，以及基于PCR的MSI檢測(cè)和通過NGS檢測(cè)DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷的MSI，并總結(jié)出6項(xiàng)建議和3項(xiàng)聲明。

第一：針對(duì)結(jié)直腸癌（CRC）患者，指南強(qiáng)烈建議病理學(xué)家使用MMR-IHC或MSI-PCR的方法確定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。雖然NGS檢測(cè)可用于確定CRC患者M(jìn)SI以評(píng)估檢查點(diǎn)抑制劑使用資格，但免疫組化和PCR是首選方法。專家小組成員認(rèn)為：“NGS檢測(cè)必須通過MMR-IHC或MSI-PCR一致性驗(yàn)證，并且必須顯示兩者具有等效性?！?/P>

第二：對(duì)于胃食管癌或小腸癌患者，應(yīng)使用MMR-IHC或MSI-PCR，而不是NGS。

第三：對(duì)于子宮內(nèi)膜癌患者，強(qiáng)烈推薦使用MMR-IHC而不是MSI-PCR或基于NGS的MSI檢測(cè)。

第四：除CRC、胃食管腺癌、小腸癌和子宮內(nèi)膜癌以外的其他癌癥類型，腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家應(yīng)注意“必須針對(duì)特定的癌癥類型進(jìn)行充分驗(yàn)證，仔細(xì)評(píng)估MMR-IHC、MSI-NGS、MSI-PCR檢測(cè)DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷的性能特點(diǎn)。”

Broaddus坦言：“第四項(xiàng)建議更多地是對(duì)巨大知識(shí)差距的關(guān)注，而不是具體的建議。廣泛的NGS檢測(cè)可能對(duì)試圖通過一次評(píng)估獲取盡可能多腫瘤分子信息的腫瘤學(xué)家有吸引力，但這種便利不應(yīng)超過這樣一個(gè)事實(shí)，即對(duì)于許多癌癥類型，尚沒有足夠的證據(jù)表明NGS可準(zhǔn)確地確定dMMR或MSI狀態(tài)。臨床醫(yī)務(wù)工作者需要意識(shí)到，如果對(duì)患者進(jìn)行NGS，可能會(huì)錯(cuò)過其他癌癥類型的高水平MSI，尤其是胃腸道癌癥之外的其他癌癥。

第五：不應(yīng)將腫瘤突變負(fù)荷（TMB）視為檢測(cè)dMMR狀態(tài)的替代指標(biāo)。如果腫瘤被確定為TMB-H，病理學(xué)家可以通過MMR-IHC或MSI-PCR的檢測(cè)，來確定TMB-H是否繼發(fā)于dMMR。雖然對(duì)于CRC，TMB-H與dMMR有很多重疊，但對(duì)于其他癌癥類型，兩者重疊很小。

對(duì)于第五條建議，Broaddus及其同事強(qiáng)調(diào)：“ TMB-H雖然在某些情況下可能是dMMR或MSI-H狀態(tài)的標(biāo)志，但并不能視為與其他兩個(gè)生物標(biāo)志物相同。”

第六：如果對(duì)患者進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)抑制劑資格分析后發(fā)現(xiàn)與Lynch綜合征一致的dMMR，強(qiáng)烈建議病理學(xué)家將此發(fā)現(xiàn)傳達(dá)給患者的主治醫(yī)生，因?yàn)檫@種遺傳性綜合征意味著會(huì)增加其他癌癥風(fēng)險(xiǎn)?！?/P>

三個(gè)良好實(shí)踐聲明集中在腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家如何處理不一致的檢測(cè)結(jié)果。這一點(diǎn)對(duì)于IHC尤其重要，因?yàn)閷＜以谠S多指南中首先推薦IHC檢測(cè)方法。不過在特定情況下，該方法可以根據(jù)病理學(xué)家的個(gè)人解釋產(chǎn)生不同的結(jié)果。新指南中包含的良好實(shí)踐聲明在處理差異方面提供了一些指導(dǎo)。

Broaddus表示：“IHC的好處在于更普遍，很多基礎(chǔ)的臨床實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行這一操作，但缺點(diǎn)是具有一定的主觀性，而且需要具備一定的專業(yè)知識(shí)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，病理學(xué)家的培訓(xùn)計(jì)劃應(yīng)該包括解釋IHC的檢測(cè)結(jié)果?！?/P>

第一：如果檢測(cè)結(jié)果不一致，病理學(xué)家應(yīng)采用IHC、NGS、PCR檢測(cè)MSI其中的任何陽(yáng)性結(jié)果，從而允許患者接受免疫治療。但對(duì)不一致的結(jié)果應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格審查，確定這種不一致的現(xiàn)象不是由錯(cuò)誤的解釋所導(dǎo)致的。

第二：如果任何方法的結(jié)果不確定，病理學(xué)家應(yīng)執(zhí)行替代技術(shù)或在不同的腫瘤塊上重復(fù)相同的技術(shù)。對(duì)不確定檢測(cè)結(jié)果的情況，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該建立一個(gè)全面的同行評(píng)審程序。

第三：在MMR-IHC亞克隆缺失的情況下，病理學(xué)家應(yīng)通過PCR進(jìn)行MSI驗(yàn)證，特別是在IHC丟失MMR蛋白的腫瘤解剖區(qū)域。

該指南對(duì)MMR-IHC的強(qiáng)調(diào)，特別是對(duì)結(jié)直腸癌、胃食管、胃食管連接處、小腸以外的腫瘤類型。Large-panel NGS無疑為癌癥患者提供了更多的基因組信息，有時(shí)甚至可以識(shí)別Lynch綜合征患者。有證據(jù)表明，MSI-NGS對(duì)于正在考慮接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的CRC、胃食管、胃食管結(jié)合部、小腸癌患者是一種很好的檢測(cè)方法。

然而，這些相同的MSI-NGS方法對(duì)于其他類型的癌癥通常不是好的檢測(cè)方法的，因?yàn)闆]有足夠已發(fā)表的證據(jù)支持。為了準(zhǔn)確檢測(cè)這些其他癌癥類型中的MSI-H，可能需要開發(fā)出每種腫瘤類型特有的替代NGS算法。

驗(yàn)證MSI-NGS方法的相關(guān)幾項(xiàng)研究中存在另一個(gè)缺點(diǎn)：MMR-IHC或MSI-PCR接近100%的一致性，這通常不能解釋由于低標(biāo)本腫瘤細(xì)胞純度（在一項(xiàng)研究中接近25%的病例）或由于不確定的結(jié)果（在一項(xiàng)研究中為15%）而排除的病例。顯然，對(duì)于許多活組織檢查或細(xì)針穿刺來說，NGS的低腫瘤細(xì)胞分?jǐn)?shù)的限制是一個(gè)重要的問題，惡性腫瘤的診斷可能僅基于少數(shù)腫瘤細(xì)胞的存在。有發(fā)表的關(guān)于MSI-NGS效用的大型研究，其包括數(shù)千名患有許多不同癌癥類型的患者，該研究數(shù)據(jù)表明：通常MSI僅在結(jié)直腸癌或子宮內(nèi)膜癌患者中通過MMR-IHC或MSI-PCR驗(yàn)證，因?yàn)閐MMR在這些癌癥類型中更為常見，而許多其他類型的癌癥缺乏關(guān)鍵的交叉分析驗(yàn)證。