PD-L1免疫組化檢測的現(xiàn)狀及存在的問題

北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司研發(fā)部 戚聞?wù)g

眾所周知，腫瘤的發(fā)生率逐年提高已經(jīng)成為一個不爭的事實，隨之而來的是人類抗腫瘤治療方法的不斷更新。腫瘤的治療在經(jīng)歷了手術(shù)、放療、化療和靶向治療后，已經(jīng)逐漸進入了免疫治療的階段。免疫治療是通過激發(fā)和增強機體抗腫瘤的免疫應(yīng)答來協(xié)同機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤、抑制腫瘤生長，是一種利用患者自身免疫系統(tǒng)對抗腫瘤的治療方式。腫瘤的免疫治療分為被動免疫治療和主動免疫治療兩類。I-O（Immuno-Oncology） 治療是主動免疫治療的主要手段之一，目前國際上I-O治療的主要研究方向是免疫檢查點抑制劑，有代表性的包括PD-1/PD-L1抑制劑和CTLA-4拮抗劑。

免疫檢查點是一類免疫抑制性的分子，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強弱和范圍，從而避免正常組織的損傷和破壞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，免疫檢查點成為免疫耐受的主要原因之一。免疫檢查點療法就是通過共抑制或共刺激信號等一系列途徑調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性來提高抗腫瘤免疫反應(yīng)的治療方法。

PD-1是T細(xì)胞表面的重要抑制分子，其胞內(nèi)段含有一個ITIM和一個免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（ITSM），ITSM介導(dǎo)了蛋白酪氨酸磷酸酶家族磷酸酶的募集以及對T細(xì)胞活化信號的抑制，其配體為PD-L1和PD-L2，主要在免疫系統(tǒng)效應(yīng)期的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的造血細(xì)胞中有誘導(dǎo)性的表達(dá)，通過與PD-1的結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生機體的免疫抑制，從而使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸，這也許是腫瘤耐受的機制之一。如果將其結(jié)合阻斷，就有可能阻斷這種免疫抑制，使機體自身的T細(xì)胞活化，從而達(dá)到免疫治療的目的。由于多種腫瘤均有可能通過上述機制進行免疫抑制，所以免疫檢查點抑制劑就有可能成為抗腫瘤的“萬能藥”。理論上講，如果能夠證實腫瘤中存在PD-1/PD-L1的高表達(dá)，那么免疫檢查點抑制劑就有可能有效，所以目前世界各大藥廠均把目光聚集在這類藥物的研發(fā)上，并且已經(jīng)先后有三種藥物經(jīng)過美國FDA批準(zhǔn)上市，預(yù)計明年也會通過CFDA認(rèn)證在中國上市。國內(nèi)的多家藥企同類藥物也有多項正在進行Ⅲ期臨床測試，市場前景廣闊。

目前FDA已批準(zhǔn)上市的免疫檢查點抑制劑有百時美施貴寶的nivolumab和默沙東的pembrolizumab，兩者均為PD-1抑制劑。nivolumab是全人源化IgG4單抗，其主要適應(yīng)癥是惡性黑色素瘤及BRAF V600野生型不可切除性或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤和頭頸部鱗癌等；pembrolizumab是人源化IgG4單抗，主要適應(yīng)癥是晚期或不可切除的惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等二線治療，更于今年10月獲NCCN推薦用于非小細(xì)胞肺癌一線治療并獲FDA批準(zhǔn)。

FDA批準(zhǔn)的PD-L1抑制劑是羅氏制藥的ateolizumab，是迄今批準(zhǔn)的唯一一個PD-L1抑制劑，為全人源化的IgG1單抗，與PD-L1高親和力結(jié)合后阻斷了PD-L1與PD-1的相互作用，達(dá)到抑制PD-1/PD-L1通路的作用，臨床試驗的適應(yīng)癥主要為非小細(xì)胞肺癌和移行性膀胱癌。

到目前為止，三種藥物的使用適應(yīng)癥大多需要進行PD-L1免疫組化檢測，絕大多數(shù)腫瘤均在高表達(dá)的腫瘤中獲得良好的效果，所以FDA在批準(zhǔn)三種藥物上市的同時，也分別批準(zhǔn)了相應(yīng)的伴隨診斷試劑。

FDA批準(zhǔn)的OPDIVO?（nivolumab）伴隨診斷免疫組化試劑為PD-L1 IHC 28-8 pharmDx，應(yīng)用兔單抗28-8和EnVision FLEX可視系統(tǒng)，在Autostainer Link 48染色平臺上檢測非小細(xì)胞肺癌（鱗癌除外）和黑色素瘤石蠟切片中PD-L1的表達(dá)狀況，從而指導(dǎo)臨床用藥。PD-L1蛋白表達(dá)的定義是腫瘤細(xì)胞所呈現(xiàn)的任何強度的細(xì)胞膜陽性的百分率，細(xì)胞質(zhì)染色（如果存在）不參與評分。在非小細(xì)胞肺癌（鱗癌除外）中，應(yīng)用該伴隨診斷試劑所檢測出的PD-L1表達(dá)與使用OPDIVO所獲得的延長生存期相關(guān)，如果PD-L1表達(dá)陰性，即<1%的非小細(xì)胞肺癌（鱗癌除外）腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出任何強度的完整的或不完整的線性化細(xì)胞膜染色，此條件下服用OPDIVO的效果與服用多烯紫杉醇（對照）的效果等同；若>=1% PD-L1表達(dá)，服用OPDIVO有41%的可能性（病人）延長8.1月生存期；若>=5% PD-L1表達(dá)，服用OPDIVO有57%的可能性（病人）延長10.1月生存期；若>=10% PD-L1表達(dá)，服用OPDIVO有60%的可能性（病人）延長11.4月生存期。在黑色素瘤中，該伴隨診斷試劑所檢測的PD-L1表達(dá)與使用藥物的無進展生存期相關(guān)。非小細(xì)胞肺中鱗癌用藥與PD-L1表達(dá)無關(guān)。

FDA批準(zhǔn)的KEYTRUDA?（pembrolizumab）伴隨診斷免疫組化試劑為PD-L1 IHC 22C3 pharmDx，應(yīng)用小鼠單抗22C3和EnVision FLEX可視系統(tǒng)，在Autostainer Link 48染色平臺上檢測非小細(xì)胞肺癌石蠟切片中PD-L1的表達(dá)狀況，從而指導(dǎo)臨床用藥。PD-L1蛋白應(yīng)用TPS（Tumor Proportion Score）來定義，即呈現(xiàn)部分或完整細(xì)胞膜染色的可視腫瘤細(xì)胞的百分率。如果TPS≥ 50%，即為PD-L1陽性，也就意味著適合用藥；反之，如果TPS在1~49%，即為PD-L1陰性，不適合用藥。

FDA批準(zhǔn)的TECENTRIQ?（ateolizumab）伴隨診斷免疫組化檢測試劑為VENTANA PD-L1 (SP142) Assay，應(yīng)用兔單抗SP142和OptiView DAB IHC檢測試劑盒，在VENTANA BenchMark ULTRA染色平臺對尿路上皮癌的石蠟切片進行PD-L1表達(dá)的分析。PD-L1表達(dá)狀況定義為任何強度PD-L1+的浸潤免疫細(xì)胞（IC）所占據(jù)的腫瘤細(xì)胞面積的百分比，腫瘤細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)不參與評分。在尿路上皮癌中≥ 5% IC與使用藥物所帶來的客觀緩解率增加密切相關(guān)。近期，該伴隨診斷試劑又?jǐn)U大至于非小細(xì)胞肺癌，其評判標(biāo)準(zhǔn)也進行了改進，除了繼續(xù)沿用針對IC表達(dá)進行評判之外，也加入了對于TC的評判，是唯一一個對腫瘤細(xì)胞和浸潤的淋巴細(xì)胞均加以考慮的檢測試劑，評估基于PD-L1任何強度表達(dá)的腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞占腫瘤面積的比例（%IC）或PD-L1任何強度表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中的比例（% TC）。 VENTANA PD-L1 (SP142)檢測測定的NSCLC組織中≥50% TC或≥10% IC有PD-L1表達(dá)可能與TECENTRIQ（atezolizumab）提高總生存率相關(guān)。

不難看出，目前針對PD-L1的檢測狀況是“One drug，One assay”，這種“一種藥物一種檢測”的模式，包括不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)，已嚴(yán)重地影響到伴隨診斷在病理日常診斷工作中的應(yīng)用。FDA在陸續(xù)批準(zhǔn)上述伴隨診斷試劑的同時，也意識到了這種問題的存在，所以由FDA牽頭，四家PD-1/PD-L1 抑制劑研發(fā)企業(yè)（AstraZeneca、BMS、Roche、Merck）、二家診斷試劑公司（Dako/Agilent 、Ventana/Roche）和二家學(xué)術(shù)機構(gòu)（IASLC：the International Association for the Study of Lung Cancer及AACR：American Association for Cancer Research）參與，進行了名為藍(lán)印倡議（Blueprint Initiative）的研究，通過對四種方法（包括目前尚未被批準(zhǔn)的SP263兔單抗）進行對比，找到其可能的一致性，用于指導(dǎo)臨床合理使用PD-1/PD-L1抑制劑。但不對抗體的好和壞進行評判；不評估檢測的特異性和敏感性；不判定臨床和治療的關(guān)系。

從階段Ⅰ的數(shù)據(jù)來看，四種檢測方法中，28-8、22C3和SP263在腫瘤染色方面一致性較好，唯有SP142是個例外；在四種方法中，免疫細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)較之腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)差異性更大（參見圖1和2）；依然有36.9%的病例表現(xiàn)出不一致的結(jié)果。免疫組化依然作為檢測PD-L1蛋白表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，鼓勵使用陽性/陰性來定義PD-L1的表達(dá)，但可能會朝向定義更加多元化的判定來替代單一的Cutoff值。

階段Ⅰ的結(jié)果對現(xiàn)階段的臨床影響有限，原因是入組的試驗樣本數(shù)量過少，樣本類型單一。隨著人們對不同免疫檢查點藥物反應(yīng)性不同背后所隱藏的生物學(xué)意義的更加深入的了解，更新的檢測方法和使用復(fù)雜的生物標(biāo)記物來捕捉腫瘤微環(huán)境的變化，以及這些變化與藥物的相關(guān)性；探索新的標(biāo)記物與治療的相關(guān)性，包括突變負(fù)荷、新抗原、基因圖譜、PD-L1基因組擴增、CTCs中PD-L1的表達(dá)、細(xì)胞游離的DNA、感染性腫瘤、復(fù)合免疫分析、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、基線血清細(xì)胞因子、LDH、基因表達(dá)特性等等，都會變得更加有意義。